双荧光素酶报告基因检测

1.       技术简介

荧光素酶是自然中能够产生生物荧光的酶，其最有代表性的就算萤火虫荧光素酶（firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（ Renilla Luciferase ）。在荧光素酶的催化下，荧光素底物发生氧化反应，从而产生荧光。通常其中一个荧光素酶基因作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。而另一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少内在变化因素对于实验准确性的影响，比如细胞数目及活力的差异，细胞转染及裂解效率。

双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。

该技术将将目的基因的调控元件构建至带有荧光素酶报告基因的表达载体中，通过荧光素酶基团的表达量来衡量目的基因调控元件的活性。通过将报告基因质粒转染细胞，根据不同的实验要求给予不同的细胞处理后，加入底物荧光素来催化luciferin发出荧光，检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控元件的影响，为了避免转染细胞时所造成的质粒量的误差，通常会同时转染Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参，所以构成了双荧光素酶报告基因系统。

2. 技术应用

（1）检测启动子的活性；

（2）分析启动子结构。通常会选择转录起始位点上有2kb的片段，通过对DNA片段的截断，或者对位点进行突变，插入报告基因载体，结合荧光素酶检测，可以分析出某片段或者某位点的活性；

（3）启动子SNP分析。某些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

（4）验证特定转录因子的调控作用。通过将转录因子表达载体与启动子报告基因载体共转染细胞后检测其双荧光素酶的活性，来判断该转录因子是否具有调控作用。

（5）验证microRNA对mRNA靶向互作。将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入目的microRNA的模拟物mimics，检测荧光素酶活性。

（6）验证microRNA对lnRNA靶向作用，将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，再共转入目的microRNA的模拟物mimics，检测荧光素酶活性。

3. 具体实验步骤

 3.1 报告基因质粒载体构建

将目的基因构建至双荧光素酶报告基因载体的上，目的片段位于荧光基因的上游，如构建至pGL3-basic。

3.2 细胞转染

将荧光素酶报告质粒与内参质粒和共转染细胞，由于内参的启动子活性较强，通常报告质粒与内参质粒的转染比例为10：1。 

3.3 荧光活性检测

（1）首先将5xPLB 裂解液加灭菌去离子水稀释成1xPLB 裂解液；

（3）每个孔加入1xPLB，摇床常温条件下摇晃15min 进行裂解；

（4）收集裂解液到EP 管中，13000rpm 4℃离心 1min，将上清转移到新的管子中。

（5）测定荧光值，96 孔酶标版中加入收集好的20 ul细胞裂解液上清，加入100ul LARII，混匀，读取读数，即为Firefly luciferase的数值；

（6）每孔再加入100ul 的STOP&GLO Reagent，再次测定数据，即为Renilla luciferase的数值；

3.4 数据处理

首先将Firefly luciferase/Renilla luciferase得出比值，再均一化control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性。