一篇文章带你了解RNA干扰

 

1. 技术简介

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的研究工具，几乎存在于所有真核生物中。

dsRNA是指双链核糖核酸，是Double-stranded RNA的缩写。当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅速产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约20～25 bp），即siRNA。

siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

 

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2. 制备方法

2.1 化学合成

在设计好siRNA序列后，可以通过化学合成的方式合成siRNA,该方法得到的siRNA可以直接瞬转细胞.

目前化学合成的siRNA主要有三种类型：普通siRNA,化学修饰的siRNA，荧光标记siRNA。

(1)       该方法的的优点是合成得到的siRNA纯度高，不需要进行其他处理即可直接用于细胞实验，快速便利。缺点是只能瞬时表达，不适用于要进行长时间的研究.

(2)       化学修饰的siRNA可以有效地增加在细胞转染中的稳定性，与普通的siRNA相比，可以有效延长作用时间；

(3)       荧光标记的siRNA可以跟踪细胞或动物体内siRNA的吸收及分配情况，可以使用荧光显微镜和流式细胞仪观察siRNA在细胞中的转染效率，可以使用激光共聚焦显微镜观察siRNA的定位。通常在5’端标记，常见的荧光标记物有FAM、CY3和CY5等。

2.2 载体介导的RNAi

把siRNA克隆到shRNA表达载体中，在细胞中作用后，也是能够形成发夹结构的非编码小RNA。shRNAs (RNA-Short hairpin RNAs)：即短发夹RNA，是由两个短反向重复序列，中间一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。由5-6个T组成RNA pol Ⅲ终止位点。shRNA质粒载体通过转染细胞，在细胞内的形成siRNA而最终发挥沉默靶基因的作用。

2.3 慢病毒介导的RNAi

把siRNA克隆到shRNA慢病毒表达载体中， 通过慢病毒包转成慢病毒，感染细胞,可以在细胞中实现长期稳定表达出siRNA,从而引起靶基因沉默。

 

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3. siRNA设计

有效的siRNA是基因沉默成功与否的关键，并非每个siRNA都能有效地引发基因沉默。关于siRNA设计，可以参考以下设计原则：

（1）每次设计的siRNA建议设计3-5个，可以增加成功的概率；

（2）siRNA的序列长度建议在19-21nt；

（3）siRNA序列的GC含量建议占比30%-50%。

（4） 设计的siRNA避免与其他基因同源，避免沉默到别的基因；

（5）多个设计的siRNA尽量分散在mRNA的全长。多个分散的位点可以避免mRNA的二级结构或蛋白结合而影响siRNA对目的mRNA的结合，分散设计可以降低风险。

（6）siRNA的反义链最好以UU结尾，这是被公认的最有效的结构。

即在设计siRNA时，先扫描mRNA上的所有AA二核苷酸，并选择AA二核苷酸往3’端方向的17-19个核苷酸。

 

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4. shRNA设计 

shRNA可由正义链的siRNA通过一段端的间隔序列与反义链siRNA相连，在核苷酸的末端增加5-6个T组成。简而言之，shRNA是由两个短反向重复序列，中间一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，由5-6个T组成RNA pol Ⅲ终止位点。关于其设计，除了需要遵循以上siRNA设计原则外，还需要注意以下几点：

（1）由两个短反向重复序列，中间一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，需加上5-6个T组成RNA pol Ⅲ终止位点；

（2）两端需要加上限制性酶切位点，方便与载体连接；

（3）最常见的颈环结构序列为5’-TCAAGAG-3’

（4）目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录，如果涉及的序列不是以G开头，则需要加上一个G;

（5）不能出现3个以上的T。