常用内参抗体的选择

蛋白质免疫印迹法(Western Blot)是用于检测蛋白相对表达量的一种技术，可通过条带的强弱来评估目的蛋白在胞内的表达情况。但是运用Western Blot技术比较不同条件下目的蛋白的相对表达量，前提条件是等量的细胞上样，这样子比较才有意义。内参顾名思义就是内部参照（Internal Control）。它们胞内的表达量相对稳定，所以在检测蛋白的表达水平变化时常用来做参照物，在Western Blot中加入内参，就是在进行Western Blot实验时，另外运用内参抗体对内参抗原蛋白进行检测，借助内参的量就可以用于校正上样误差，这样定量的结果才更可信。

常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin 或beta-tubulin 。最近的国外文献报道中使用GAPDH内参的较多。

 

在实验过程中，我们应该怎么选择合适的内参抗体呢？我们可以根据以下方法进行选择。

 

1. 考虑样本来源

（1）哺乳动物来源的样本，通常可以选择GAPDH、β-actin、β-Tubulin、Histone H3等都是可以的；

（2）如果是植物来源的样本，需要选择植物内参，比如Plant actin；

（3）如果是其他来源的样本，可以参考文献进行选择。

（4）另外，细胞内不同组成的蛋白，选择的内参抗体也是不同的，例如核蛋白可以选用Lamin B1内参。以下是几种常用抗体的分子量及其定位情况：

内参名称	分子量大小（KDa）	定位
GAPDH	36KDa	胞浆和全细胞
β-actin	42KDa	胞浆和全细胞
β-Tubulin	50KDa	胞浆和全细胞
Histone H3	16KDa	细胞核
Lamin B1	67KDa	细胞核
Plant actin	42 KDa	植物内参

 

 

 

2. 考虑内参蛋白的表达稳定性

确保选择的内参在样品中高表达。大多数常用的内参蛋白是由保守基因高表达的，这些保守基因是细胞发育及维持细胞活力所必须的（即看家基因）。

此外，还应该选择表达不受实验变量影响的内参。最佳的内参应当不受样本来源（如正常和疾病样本）、实验条件的影响。例如，GAPDH 不适用于氧相关研究，因为缺氧可能上调 GAPDH 的表达。

 

3. 考虑目的蛋白的分子量大小

在进行Western Blot检测时，当目的蛋白的大小与内参蛋白的大小相近时， WB 结果无法直接观察，不容易区分目的蛋白，很难进行准确数据的分析。建议二者至少相差5KD以上。例如目的蛋白的分子量在40KDa时，不建议选择GAPDH和β-actin，可以选择β-Tubulin。