做好荧光定量PCR实验的10个关键，你知道多少？

荧光定量pcr是一种相对准确的定量pcr方法，可用于mRNA，MicroRNA，circRNA，lncRNA等表达量分析。
本文介绍了荧光定量PCR引物设计原则、探针设计原则、引物退火温度、模板浓度、残余污染等细节PCR掌握验结果的影响，掌握这些知识将有助于我们做好荧光定量PCR实验。
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如何做好荧光定量PCR？你要知道以下知识！
1.目的基因的搜索和比较
目的基因一般由NCBI数据库查询可靠的序列，这里不做太多叙述。
2.引物和探针设计
引物设计原则：
a)引物和模板序列应遵循紧密互补的原则
b)引物应避免形成稳定的二聚体或发夹结构
c)在模板的非目的点，引物不能引起DNA错配现象
d)引物长度更适合20-25bp之间，Tm值在55-65℃，CG产品大小应为40%-60%bp之间
e)引物3端应避免出现3个连续碱基；引物3端应避免使用碱基A
f)跨内含子设计引物(跨两个为宜)
探针设计原则：
1)探针位置尽可能靠近上游引物
2)探针的5端应避免使用碱基G
3)整个探针中碱基C的含量应明显高于碱基CG
4)探针长度一般为20-30bp，Tm值在65-70℃(通常比引物高5-100℃），CG含量应为40%-70%
为了更有效地设计适合荧光定量PCR引物和探针，我们可以使用引物设计软件。因为大多数引物设计软件都包含引物/探针Tm值、互补性、二级结构、扩增子大小等重要因素的可调参数。
3.引物退火温度
引物的一个重要参数是熔化温度（Tm）。这是当50%的引物和互补序列表现为双链时DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必要的。在理想状态下，退火温度足够低，以确保引物的有效退火，但也足够高，以减少非特异性的结合。合理的退火温度为55℃到70℃。退火温度一般设置在比引物Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析。大多数计算机程序使用近邻分析——从序列一级结构和相邻碱基的特性来预测引物的杂交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物Tm值。在设置退火温度时，可以进行如下：低于估计Tm5℃作为起始退火温度，以2为基础℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得zui结果，两个引物应该是相似的Tm值。引物对的Tm如果差异超过5℃，由于循环中退火温度较低，会出现明显的错误。若两个引物Tm不同的退火温度设置为最低比例Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以根据高的基础上Tm设计的退火温度先进行5个循环，再根据较低的退火温度进行5个循环Tm剩余循环设计的退火温度。这使得目的模板在更严格的条件下可以部分复制。
4.引物浓度
引物的浓度会影响特异性。最佳引物浓度一般为0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物的扩大。为了确定引物浓度，可在260nm（OD260)测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数倒数（nmol/OD），通过Beers规则(公式1)计算引物浓度。可用公式2计算微摩消光系数。与大分子双链。DNA可以使用不同的平均消光系数，必须使用计算的消光系数来确定引物的准确浓度。这是因为引物短，碱基组成差异很大。oligo引物的消光系数可以在软件上计算（OD/μmol）以及消光系数的倒数（μmol/OD）。
一般商业合成的引物为一般商业合成O.D.一般情况下，20个碱基长引物，1个碱基长引物，1个碱基长引物，1个碱基长引物，1个碱基长引物，1个碱基长引物，1个碱基长引物。O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO软件，根据引物的消光系数，（OD/μmol），计算一定工作浓度下引物的加水量。
浓度（μM）＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数倒数（nmol/OD）
例如：计算寡核苷酸（溶于1）ml水中)，取其中10个μl稀释100倍(加990倍)μl）水中。在A260处测量的吸光度为0.2.计算消光系数的倒数为4.8nmol/OD，代入得：
浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM
5.引物、探针的纯度和稳定性
大多数定制引物的标准纯度PCR应用程序就足够了。有些应用程序需要纯化，以去除合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列是由于产生的DNA合成化学的效率不是100%。这是一个循环过程，在添加每个碱基时使用重复的化学反应，使每个碱基都能使用重复的化学反应DNA从3"到5"合成。任何循环都可能失败。较长的引物，特别是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
引物产量受合成化学效率和纯化方法的影响。定制引物以干粉的形式运输。最好在干粉中运输。TE最终浓度为100μM。也可以用双蒸水溶解。
引物的稳定性取决于储存条件。干粉和溶解引物应储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可稳定保存6个月，但在室温下(15)℃到30℃）只能保存不到一周。干粉引物可在-200℃在室温下保存至少1年(15)℃到30℃）最多可保存2个月。
探针是寡核苷酸，用于标记荧光基团，标记效率本身的差异。探针标记后，一般应纯化。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，而且可保存一年以上。不同生物技术公司的探针标记效率和纯度差别很大。
由于反复冻融容易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。
6.热启动
热启动PCR除了好的引物设计，改进PCR最重要的特异性方法之一。尽管如此。TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度为72℃，聚合酶在室温下仍有活性。因此，正在进行中。PCR在反应制备过程中，当热循环开始时，当保温温度低于退火温度时，会产生非特异性产物。这些非特异性产物一旦形成，就会有效扩展。当引物设计中使用的位点因遗传元件的定位而受到限制时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程遗传元件的施工和操作，热启动PCR尤为有效。
限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热状态PCR仪器。该方法简单便宜，但不能完全抑制酶的活性，因此不能完全消除非特异性产物的扩张。
热启动通过抑制成分的延迟DNA合成，直到PCR仪器达到变性温度。包括延迟添加。TaqDNA大多数手动热启动方法，包括聚合酶，都非常乏味，特别是对于高通量的应用。其他热启动方法使用蜡保护层包裹镁离子或酶等基本成分，或将模板和缓冲液等反应成分物理隔离。在热循环中，由于蜡熔化，各种成分被释放并混合在一起。与手动热启动方法一样，蜡保护层更乏味，更容易污染，不适合高通量应用。
7.镁离子浓度
镁离子影响PCR很多方面，如DNA聚合酶的活性会影响产量；再比如引物退火，会影响特异性。dNTP结合模板和镁离子，减少酶活性所需的游离镁离子量。zui不同引物和模板的镁离子浓度不同，但包括200μMdNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带荧光探针的镁离子溶液(普通)PCR是1.5mM）。较高的