Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡

1. 细胞凋亡介绍

细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下,受内在遗传机制控制,按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。在生物体进化、内环境的稳定以及发育过程中起着重要作用,具有重要生物学意义及复杂的分子生物学机制。

在生物学研究过程中常常需要检测细胞凋亡情况。目前至少有十数种检测细胞凋亡的方法,大致可分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。每一方法都有其优缺点,需要根据实际情况选择适合的细胞凋亡检测方法。

基于细胞形态的方法:如电子显微镜观察法、细胞核形态染色法

基于生物学功能的方法:如Annexin-V/PI双染法、线粒体膜电位变化检测;

基于生化标记的方法:Caspase-3活性检测、DNA损伤检测、TUNEL法(DNA片断原位标记法)

这里主要讲述Annexin-V/PI双染法。

 

 


 

 

 

2. Annexin-V/PI双染法技术简介

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)位于正常细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖磷脂结合蛋白,对PS具有高度亲和力。将荧光标记(FITC、PE或 biotin)的Annexin V作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。PI不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来(Annexin-V/PI法)。Annexin V联合PI法更加省时,结果更为可靠,是目前检测细胞凋亡的一种方法。

 

 


 

 

 

3. 实验方法

(1)细胞样本于1000rpm离心5min,弃上清。

(2) PBS重悬洗涤两次,于1000rpm离心5min,弃上清,加入500μl 1X Annexin V buffer轻轻重悬细胞。

(3) 加入5μl Annexin V-FITC 和5μl碘化丙啶染色液,轻轻混匀。
(4) 室温(20-25℃)避光孵育15min。可以使用铝箔进行避光。

(5)随即进行流式细胞仪检测。

 

 


 

 

 

4. 结果案例

结果说明:

1)左上象限:FITC-/PI+,为机械损伤细胞;

2)左下象限:FITC-/PI-,为活细胞;

3)右上象限:FITC+/PI+,为非活细胞,即坏死细胞或晚期凋亡细胞;

4)右下象限:FITC+/PI-,为早期凋亡细胞;

 

 

2022年8月1日 21:22
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