双荧光素酶检测miRNA靶标
1. 技术简介
microRNA（miRNA）是一种内源性的小RNA分子，在参与真核生物调控发育过程中起着重要的作用。其最常见的调控功能是通过碱基互补配对的方式结合靶基因mRNA的3’UTR区，引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译使其蛋白水平下降。荧光素酶是自然中能够产生生物荧光的酶，其最有代表性的就算萤火虫荧光素酶（firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（ Renilla Luciferase ）。在荧光素酶的催化下，荧光素底物发生氧化反应，从而产生荧光。通常其中一个荧光素酶基因作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。而另一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少内在变化因素对于实验准确性的影响，比如细胞数目及活力的差异，细胞转染及裂解效率。
2. 实验原理
结合双荧光素酶报告系统，检测miRNA对靶基因的结合情况，是目前最常用的一种方法。该技术将预测靶基因的3’UTR构建到pCHECK2.0载体（含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因）上，同时合成miRNA mimics，两者共转染细胞，一定时间后裂解细胞，通过双荧光素酶试剂盒检测萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶的发光值，判断miRNA是否能结合3’UTR并调控其表达。
说明：miRNA与3’UTR-WT结合后，理论上会降解目的基因，导致无荧光。但是在实际实验过程中，由于miRNA并不能完全结合3’UTR-WT，故仍然会检测到少量荧光。
3. 具体实验步骤
3.1 信息查询
通常情况下，需要先查询miRNA的序列和靶基因的3’UTR序列，通过软件预测该miRNA在靶基因上是否有结合位点；
3.2 报告基因质粒载体构建
将目的基因构建至双荧光素酶报告基因载体的上，目的片段位于荧光基因的下游，如构建至psiCHECK™-2载体中hRluc基因的下游。
另外，miRNA一般可以直接通过合成miRNA 对应的模拟物mimics即可，不需要再另外构建载体。
3.3 转染细胞
将荧光素酶报告质粒与内参质粒和Mimics共转染细胞，由于内参的启动子活性较强，通常报告质粒与内参质粒的转染比例为10：1，Mimics的使用终浓度是100nM。如果报告质粒载体用的psiCHECK™-2，该载体上已经有内参基因，不需要再转染内参质粒。
3.4 荧光活性检测
（1）首先将5xPLB 裂解液加灭菌去离子水稀释成1xPLB 裂解液；
（3）每个孔加入1xPLB，摇床常温条件下摇晃15min 进行裂解；
（4）收集裂解液到EP 管中，13000rpm 4℃离心 1min，将上清转移到新的管子中。
（5）测定荧光值，96 孔酶标版中加入收集好的20 ul细胞裂解液上清，加入100ul LARII，混匀，读取读数，即为Firefly luciferase的数值；
（6）每孔再加入100ul 的STOP&GLO Reagent，再次测定数据，即为Renilla luciferase的数值；
3.5 数据处理
首先将Firefly luciferase/Renilla luciferase得出比值，再均一化control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性。
