Pull down实验
1. 技术简介
Pull-Down的概念与Co-IP类似，Pull-Down旨在证明两种蛋白质之间的相互作用或探索可与目的蛋白结合的未知蛋白。Pull-Down不同于IP或Co-IP之处在于,它不是基于抗体-抗原相互作用，而是通过将诱饵蛋白通过非抗体亲和系统固定到基质上，从而获取与已知诱饵蛋白结合的蛋白或配体。
1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白，从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST融合蛋白可以与谷胱甘肽GSH的相互作用而被吸附。从而GST融合蛋白就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠。
2. 实验原理
将已知的诱饵蛋白构建到GST融合表达载体，诱饵蛋白于GST标签融合表达，获得的GST诱饵融合蛋白就可以与GSH-琼脂糖磁珠/树脂结合，若环境中存在与诱饵蛋白互做的蛋白，则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-诱饵蛋白-互作蛋白”复合物，与诱饵蛋白互做的蛋白即可经免疫印迹或质谱检测。
3. 实验流程
（1）诱饵蛋白载体构建：构建诱饵蛋白的原核表达载体；
（2）制备结合蛋白：
如果是验证类型，目的蛋白的获取有三种方法：a. 通过构建原核载体经过原核表达获取；b. 通过构建真和表达载体经过转染细胞后在胞内表达获取；c. 如确定目的蛋白的在胞内表达，且表达量不宜太低，可通过提取细胞或组织蛋白获取；
如果是筛选类型，一般通过提取细胞或组织蛋白的来获取即可。
（3）原核表达纯化诱饵目的蛋白；
（4）诱饵蛋白与目的蛋白抗原孵育；
（5）洗脱，去除非特异性结合蛋白；
（6）鉴定，如果是验证蛋白结合，可通过Western blot检测；如果是筛选结合蛋白，可通过质谱检测。
4.客户提供
（1）基因信息（物种，Genebank登录号或者序列）；
（2）基因模板，如无可以委托我们进行全基因合成；
（3）抗体，可选择
（4）细胞样本或者组织样本。
5.客户提供
（1）基因信息（物种，Genebank登录号或者序列）；
（2）基因模板，如无可以委托我们进行全基因合成；
（3）细胞样本或者组织样本。
6. 实验案例
下面我们用GST Pull down的方法来验证X蛋白与细胞中的Y蛋白是否存在相互作用。
实验材料：
- （1）构建好的GST-X原核表达载体
- （2）GST原核表达空载体
- （3）细胞样本
6.1 实验设计
本次实验，我们按照以下组别来设计实验组和对照
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组别 |
组别信息 |
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对照组 |
GST蛋白与细胞裂解液孵育进行Pull down实验后，检测Y蛋白 |
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实验组 |
GST-X融合蛋白与细胞裂解液孵育进行Pull down实验后，检测Y蛋白 |
6.2 诱饵蛋白原核表达
（1）将GST-X质粒接种到BL21大肠杆菌菌株中，转化，涂板，倒置培养；
（2）挑单菌落接种于4ml LB培养基中，摇菌培养过夜；
（3）再将菌液按1:30比例接入LB培养基中，摇菌培养2-3个小时至菌液OD600值为0.6左右。
（4）加IPTG诱导，培养3h后收菌，离心，弃上清；
（5）裂解菌液，离心取上清后进行SDS-PAGE电泳，检测诱饵蛋白的表达情况。
6.3 GST融合蛋白于树脂结合
（1）取适量的GSH树脂，用PBST洗3次，再用PBS洗一次，备用
（2）将新鲜制备的细菌蛋白上清加入GST树脂中（留一部分细菌裂解液作为Input），混合仪上4℃孵育。
（3）对孵育后的样品进行离心，弃上清，用细胞裂解液洗3次
6.4 Pull down
（1）制备细胞目的蛋白裂解液，将其加入上一步的树脂中，混合仪上4℃孵育过夜
（2）离心，将树脂与蛋白裂解液分离，弃裂解液，用细胞裂解液洗树脂3次，再用PBS洗1次
（3）用还原型谷胱甘肽洗脱；
（4）离心，将GST树脂与蛋白裂解液分离，将还原型谷胱甘肽吸入新的1.5mlEp管中，即为pull down 产物
6.5 Western blot检测
将上述制备好的pull down 产物分别加Loading buffer煮样，离心，做WB，使用Anti-Y抗体进行检测
6.6 结果分析
图 X 蛋白与Y蛋白Pull down互作图。Pull-down用GST，IB用GST和Y抗体。实验共分为2组：实验组：GST-X加，细胞裂解液加；对照组：GST加，细胞裂解液加
结论：从上述图中可知，通过GSG-Pull down实验，检测到X蛋白于Y蛋白存在相互作用。
