蛋白质不表达？原因很简单

载体结构错误
这种情况并不少见，许多克隆夫妇经常会弄错读码框。Qiagen的pQE系列载体的克隆位点通常有一两个碱基；此外，有些酶产生粘端，有些酶产生平端，容易导致读码框错误，无法表达。
宿主菌选择不当
不同的宿主菌有不同的基因类型。一些经过特殊修改的载体，或特殊用途的载体，或有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌来表达。因此，当你的蛋白质没有表达出来时，考虑更换宿主菌。
密码子使用频率低
有些基因本身含有许多稀有密码子，特别是起始密码后15个碱基中的稀有密码子，对蛋白质表达有非常重要的影响。优化密码子似乎对原核表达有很好的效果，但可能对真核表达系统没有很好的效果。有一次，有人在毕赤酵母中表达了一种两年失败的蛋白质，试图表达密码子优化，但结果还是没有表达出来。一怒之下，优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达出奇的高！这是一个痛苦的笑话，但却是一个真实的故事。但有一点我可以肯定地说:对于真核表达，密码子优化只能起到锦上添花的作用(确认有表达，提高表达量)，不能及时帮助(如果没有表达，密码子优化很可能无效)。
质粒不稳定或质粒丢失
pET该系统通常相对稳定。但的。但是，当你选择带有氨苄青霉素抗性的载体时，它可能会产生氨苄青霉素抗性。β-lactamase抗生素降解使质粒流失。另一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒，导致质粒流失。这种情况在真核表达系统中更为常见。
蛋白酶降解蛋白质
这通常是由重组蛋白本身引起的N-或C-它是由蛋白质序列引起的。N-端是Arg,Leu,Lys,Phe,Trp,或Tyr这些氨基酸很容易被蛋白酶降解，即N-末端规则。N-端是Met当时，大肠杆菌可以悄悄地把这个放在一边Met偷，尤其是Met后面跟着一个带小侧链的氨基酸。C-当末端有非极性氨基酸时，蛋白质很容易降解。C最后五种氨基酸极性或带电荷，不易降解。
六级翻译的起点
这种情况发生在你的序列中，它只包含与核糖体结合点完全一致的序列。难怪人们很高兴找到这个位置，然后开始翻译，导致你的蛋白质缩短，电泳时看不到预期的片段。
7SD序列
这并不陌生，对吧？考研时，老师喜欢用名词来解释。难怪人们总是用这个来解决问题----SD序列和起始密码子序列(80%是AUG，也有GUG)距离对蛋白质表达的效率也有重要影响。SD序列本身的组成也对翻译效率有影响。有时，为了减少包容的产生，特别是包容的产生SD修改序列！
8mRNA的二级结构
在克隆之前，你必须看看你的序列中是否有与核糖体结合的序列和/或翻译起点互补的序列。例如，您最好更改同义密码。否则就会形成mRNA二级结构，会使翻译嘎然而止。
9意外终止
这种情况见于PCR当扩展序列时，你会开个小玩笑。例如，它会在序列中间开玩笑TAC突变为TAA，让你的蛋白质翻译刹车。所以在表达之前，一定要进行测序，避免这种情况。
10转录终止子
转录终止子的存在可以促进蛋白质表达；但缺失会导致蛋白质表达；“通读”没完没了地读下去。这是在读。pET系统中没有问题，因为它在靶基因的相反方向有选择性地标记基因。如果你的靶基因和标记基因的方向正好相同，那么你必须看看你的靶基因之后是否有转录终止。如果没有，他们会在黑暗中竞争，争相生成mRNA和蛋白质。
11mRNA的不稳定性
靶基因的mRNA经常聚集在细胞中。但是大肠菌。mRNA以及它的不稳定性。如果是的话。mRNA的5"-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子插入稳定结构序列，可促进非依赖性终止子插入mRNA稳定性。特别是5"如果末端有一个没有突出发夹结构的发夹结构，它可以使结束mRNA细胞浆中没有生命之虞。
12检测方法的可行性
有时，蛋白质确实表达出来，但表达量很低，或者非常接近杂带，导致你错误地认为蛋白质没有表达出来。此时，不要忘记生物实验的两个黄金标准：比较和重复。说到比较，有很多层次的含义。最基本的意义是建立一个空载体比较。核心系统中表达的蛋白质通常很低。所以你并不总是认为WB和SDS-PAGE测试一下。此时，你必须阅读更多的文献，找到一种新的方法来发现这种蛋白质具有大米的特殊性质——例如，如果它有酶活性，它只是一个便宜的你。例如，有些蛋白质有不同的性质，比如流感病毒HA，你用不同梯度稀释的蛋白质做血凝。如果有血凝，有一定的梯度关系，那是肯定的。