qPCR 的绝对定量与相对定量

使用数字PCR法律绝对定量
数字PCR工作原理是将样品分割成许多单独的实时荧光定量PCR这些反应部分包括目标分子(阳性)，而其他部分不包括(阴性)。PCR经分析，部分阴性结果用于生成样品中目标分子精确数量的绝对结果，无需参考标准产品或内源性对照产品。
数字PCR使用阳性(白色)和阴性(黑色)PCR反应的比例计算目标分子的数量。
使用标准曲线法进行绝对定量
用于绝对定量的标准曲线法类似于用于相对定量的标准曲线法，但必须先通过其他独立方法获得标准产品的绝对量。
绝对定量扩增图和标准曲线
关键指南
正确使用绝对定量中的标准曲线至关重要：
来自单一纯物种DNA或RNA非常重要。例如，大肠杆菌制备的质粒DNA它通常存在RNA污染，这将增加A260的读数增加了质粒制数的计算结果。
由于标准液是必要的，因为标准产品需要按不同的数量级顺序稀释。DNA或体外转录RNA必须浓缩以获得准确性A260测量值。浓缩的。DNA或RNA106必须稀释–1012倍以获得与生物样品中目标分子相似的浓度。
稀释标准产品的稳定性也需要注意，特别是对于稀释标准产品的稳定性RNA。将稀释的标准品分成多份，储存在–80°C只有在使用前才能解冻。
一般不能使用DNA作为RNA绝对定量的标准产品，因为逆转录过程的效率没有对比。
标准品
必须通过其他独立方法获得标准产品的绝对量。质粒的绝对量DNA和体外转录RNA通常用于制备绝对标准产品。浓度可在。A260处测量，并通过使用DNA或RNA分子量转化为拷贝数。
相对定量
相对定量的计算方法
相对定量可根据所有实时荧光定量PCR进行仪器获取的数据。相对定量的计算方法有：
标准曲线法
比较CT法