什么是实时荧光定量PCR (RT-PCR，qPCR)？
实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
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关于序列检测试剂
我们开发了两种通过使用序列检测系统（SDS）仪器进行PCR产物检测的试剂：
TaqMan方法
TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。
使用TaqMan方法的检测类型
TaqMan方法可用于以下检测类型：
定量，包括：
用于RNA定量的一步法RT-PCR
用于RNA定量的两步法RT-PCR
DNA/cDNA定量
等位基因检测
通过IPC进行的正负检测
SYBR Green I染料试剂
SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems SYBR Green I染料，一种可以在PCR循环过程中随着PCR产物的累计而对其进行检测的高度特异性双链DNA结合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂可以检测所有双链DNA，包括非特异性的反应产物。因此这样经过特别优化的反应体系，对于获取准确的结果而言是非常必要的。
使用SYBR Green I染料法的检测类型
SYBR Green I染料法可用于以下检测类型：
用于RNA定量的一步法RT-PCR
用于RNA定量的两步法RT-PCR
DNA/cDNA定量
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TaqMan试剂
最初，使用嵌入式染料进行实时荧光PCR (qPCR) 产物定量。但这些染料存在重大缺点，即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。
TaqMan方法的开发
通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。
TaqMan序列检测方法的工作原理
TaqMan试剂通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。工作原理：
步骤、过程
构建一段寡核苷酸探针：5’端标记荧光染料报告基团，3’端标记淬灭染料基团。当探针保持完整时，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移（FRET）而显著降低由报告染料基团发射的荧光。
如果存在目标序列，探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火，并随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除。
探针的切除将会引起：
将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离，增强了报告染料基团的信号。
将探针从目的链上去除，使引物继续沿模板链末端延伸。因此，探针的介入并不会抑制整个PCR过程。
每经过一个循环，就会有更多的报告基因染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。
两种类型的 TaqMan 探针
我们可提供两种类型的Applied Biosystems TaqMan 探针：
TaqMan探针（含有Invitrogen TAMRA染料——淬灭染料基团）
Applied Biosystems TaqMan MGB探针
推荐用于等位基因检测的 TaqMan MGB 探针
我们一般推荐使用TaqMan MGB探针进行等位基因分型分析，特别是当传统TaqMan探针超过30个核苷酸时。TaqMan MGB探针包含：
位于3’ 端的非荧光淬灭基团——由于淬灭基团不发出荧光，因此SDS仪可以更精确地检测出报告基因染料 。
位于3’ 端的小沟结合物 – 小沟结合物可提高探针的熔解温度（Tm），缩短探针的长度。
最终，TaqMan MGB 探针会在匹配和未匹配探针之间展现出更大的 Tm 值差异，从而提供更准确的等位基因分型。
TaqMan 方法的优点
需要在探针和目标分子（靶点）之间发生特异性的水解（杂交），方可生成荧光信号
您可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列
无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。
TaqMan方法的缺点：
TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。
