iTRAQ技术

1. iTRAQ技术简介

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification) 同位素标记相对和绝对定量技术，是目前运用最广泛的标记定量蛋白质组技术之一，借助体外同位素标记物通过与氨基酸N末端氨基以及赖氨酸残基的游离氨基结合，实现对多肽的标记，通过质谱高分辨率质谱仪串联分析方法，高通量的筛选不同样本间总蛋白质组的表达差异。iTRAQ可同时比较多达8种样品之间的蛋白质表达量，同时兼具灵敏度高、分离能力强、适用范围广、高通量、结果可靠和自动化程度高等优点。iTRAQ 技术已成为目前定量蛋白质组学中一个十分重要的技术，其作用已经在许多生物体和组织研究中得到证明。

2. iTRAQ标记原理

iTRAQ试剂由三部分组成：报告基团（Report Group），平衡基团（Balance Group）和肽反应基团（Peptide Reactive Group）。肽反应基团可与肽段N-端或赖氨酸侧链基团发生反应形成共价键从而完成对肽段的标记。目前iTRAQ试剂主要有两种：4-plex和8-plex，可同时标记4组或8组样品。

（1）报告基团为 N-甲基哌嗪部分，作为定量组分或报告离子，出现在 MS\MS 谱图的低质量区，共有8种，质量数分别为113-121Da(无120)，因此iTRAQ 试剂可最多同时标记8 组样品；

（2）平衡基团的质量分别为192-184Da(无185)，与报告部分相互配合，使得itraq试剂分子量均为305 Da，保证iTRAQ试剂标记的不同样本同一肽段具有相同的质荷m/z比；

（3）肽反应基团为 N-羟基二酰亚胺，将iTRAQ试剂与肽段上N端氨基酸残基以及赖氨酸相连，在其上报告基团通过平衡基团与反应基团相连，形成等量异位标签。

3. iTRAQ实验原理

4. iTRAQ实验流程

（1）收集样本并分别对样本进行蛋白质提取定和定量；

（2）对蛋白质进行还原、封闭后进行酶解，得到多肽混合物；

（3）用iTRAQ试剂对各组样本的肽段混合物进行标记，使不同iTRAQ试剂标记样品中的所有肽，并等量混合各组标记后的多肽样本；

（4）对混合后的多肽样品进行RPLC-MS反相色谱-串联质谱检测及分析。在一级质谱图中，不同iTRAQ同位素标记的同一肽段后分子量完全相同，所以不同来源的同一蛋白同一标记肽段在一级质谱图中呈现相同；

（5）收集一级质谱图中同一个峰的样品，得到不同样品的相同肽段混合物，进行二级质谱，得到二级质谱图。此时报告基团、平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，平衡基团丢失，带不同同位素标记的同一多肽产生质量为113，114，115，116，117，118，119和121Da的报告离子（8-plex），报告离子呈现出不同的峰。