1. 技术简介

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的研究工具，几乎存在于所有真核生物中。

dsRNA是指双链核糖核酸，是Double-stranded RNA的缩写。当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅速产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约20～25 bp），即siRNA。

siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

 

2. shRNA制备

shRNA可由正义链的siRNA通过一段端的间隔序列与反义链siRNA相连，在核苷酸的末端增加5-6个T组成。简而言之，shRNA是由两个短反向重复序列，中间一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，由5-6个T组成RNA pol Ⅲ终止位点。关于其设计，除了需要遵循以上siRNA设计原则外，还需要注意以下几点：

（1）由两个短反向重复序列，中间一茎环（loop）序列分隔，组成发夹结构，需加上5-6个T组成RNA pol Ⅲ终止位点；

（2）两端需要加上限制性酶切位点，方便与载体连接；

（3）最常见的颈环结构序列为5’-TCAAGAG-3’

（4）目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录，如果涉及的序列不是以G开头，则需要加上一个G;

（5）不能出现3个以上的T。

 

3. 实验过程

（1)针对目的基因设计3-4个siRNA,分别加上合适的酶切位点，颈环结构和其他需要的碱基，组成shRNA;

（2) 合成shRNA引物；

（3）引物退火即可获得双链的shRNA;

（4）对载体进行双酶切，胶回收后得到线性载体；

（5）载体与shRNA连接，转化至宿主菌中扩增；

（6）跳去单克隆菌株进行测序验证。