研究基因调控机制的套路
研究基因调控机制的套路
在某些临床情况下，如骨折不愈合、假关节病、成骨不全和骨质疏松症，增强成骨仍然是困扰医生和研究人员几十年的医学难题。增加成骨前体分化和矿化是一项重要策略，是解决这些医学难题的研究重点。为了促进骨的形成，研究者们探索和研究了多种分子。目前BMP2和BMP7已经应用于临床医疗，他们在成骨中起着重要的作用，且具有骨诱导的能力。但是也出现了一些不可忽视的问题，比如高成本，异位骨形成和高剂量导致水肿等。LIM1被证明是一种新的诱导成骨和软骨形成的分子，但是其促进骨形成的机制仍不清楚。
LIM Mineralization Protein-1 Enhances Bone Morphogenetic Protein-2–Mediated Osteogenesis Through Activation of ERK1/2 MAPK Pathway and Upregulation of Runx2 Transactivity
这篇论文的目的旨在研究LMP1通过什么样的机制来诱导骨生成 .
根据前期的研究已知：
（1）LMP1可以诱导骨形成；
（2）LMP1可以促进BMP上调；
（3）BMP上调是LMP1促进成骨形成的关键机制。
（4）BMP-2已经投入临床使用，已经被证明在成骨和诱导成骨中起重要的作用。
根据前期的研究，提出以下问题：
（1） LMP1是怎么促进LMP上调的呢？
（2） LMP1是怎么诱导骨形成的呢？
我们现在已经弄清楚了背景和已知的研究进度，故研究的思路设计如下
（1）过表达/干扰LMP1，检测基因水平蛋白水平相关基因的表达；
（2）过表达/干扰LMP1，检测骨形成情况；
（3）双荧光素酶检测LMP1是否通过转录调控的方式调控BMP2启动子表达，通过设计干扰LMP1进一步验证
（4）预测调控BMP2启动子的转录因子，找出转录因子（RUX2）
（5）通过双荧光素酶检测LMP1是否可以调控转录因子（RUX2）的表达
（6）双荧光素酶检测在转录因子（RUX2）过表达和干扰下，检测LMP1调控BMP2的情况；
（7）过表达LMP1，WB和qpcr检测RUX2的表达情况
（8）过表达LMP1，同时过表达/干扰RUX2，WB和qpcr检测RUX2和BMP2的表达情况
（9）过表达LMP1，chip富集RUX2，凝胶跑PCR产物，检测LMP1是否可以影响RUX2对BMP2的富集；
（10）突变BMP2启动子，转染LMP1，RUX2，双荧光素酶检测BMP2启动子活性变化
（11）找通路，通过过表达LMP1,加入相关通路的抑制剂，检测通路相关蛋白的表达水平，，最终确定与ERK1/2 pathway相关
（12）过表达LMP1，加入通路抑制剂后，发现BMP2的启动子活性是否有变化（下降）。无过表达LMP1，加入抑制剂，BMP2的启动子活性无明显变化。
实验材料（细胞）
（1） MC3T3-E1 subclone 14
（2） The primary rat osteoblasts (ROBs)
实验方法
（1） 培养以上两种细胞
（2） 质粒转染：LV-LMP-1和LV-Runx2、LV-shLMP-1、lv shRunx2、LV-shBMP-2
（3） RT-QPCR检测：LMP-1、BMP-2、Runx2、碱性磷酸酶(ALP)、COL1A1和骨钙素(OCN)
（4） WB检测：BMP-2、Runx2、LMP-1、Flag、phospho-ERK1/2、anti-ERK1/2、phospho-p65、p65、phospho-p38、p38、phospho-c-Jun、c-Jun
（5） CHIP-qPCR：Runx2和BMP-2 promoter
（6） 双荧光素酶报告基因检测： Runx2和BMP-2 promoter。
（7） 茜素红检测骨形成
结果
（1）LMP-1过表达可以促进BMP2基因表达
过表达LMP1，LMP1和BMP2在mRNA和蛋白水平都升高, ALP、COL1A1和OCN升高；干扰LMP1，LMP1和BMP2在mRNA和蛋白水平都降低, ALP、COL1A1和OCN降低。
（2）LMP-1可以促进骨形成，但是BMP2是 LMP-1促进骨形成的必须因素
转染过表达的LMP1后，茜素红表达量升高，转染LMP1+sh BMP2，茜素红表达量降低。转染shLMP1后，茜素红表达量降低，转染shLMP1+ BMP2，茜素红表达量恢复。
（3） LMP1通过转录调控BMP2的表达。
通过双荧光素酶检测，在过表达LMP1后，BMP2的启动子活性增强通过预测，发现了在BMP2启动子上有RUX2转录因子的结合位点。故提出假设LMP1通过调节RUX2启动子来调节BMP2的表达。
这一假设是否成立呢？接下来要验证这一假设。
（4）通过一系列的实验如双荧光素酶实验、RT-qpcr和WB， chip实验等，说明LMP-1通过 Runx2 调控 BMP-2；
（5）通过加入通路抑制剂，结合过表达干扰实验，发现LMP-1通过激活RK1/2 MAPK通路来促进Runx2 和 BMP-2的表达：
a. 加入LMP1后，基因水平和蛋白水平明显升高
b. 在加入LMP1和加入抑制剂，只有ERK1/2 pathway相关基因明显增加
c. 加入抑制剂后，BMP-2启动子活性受到影响
总结
作者通过过表达、干扰实验、双荧光素酶报告基因检测实验，发现LMP1是通过转录水平来调控BMP2蛋白的表达，再一次通过过表达、干扰实验、双荧光素酶报告基因检测实验证实LMP1是通过RUX2来调控BMP2蛋白的表达，进而促进成骨。另外，通过添加通路抑制剂，来证实LMP1是通过ERK1/2通路来调控BMP2的表达，进而促进成骨形成。
针对某个基因（A）引起某种表型的机制，我们这里可以根据这篇文章总结一下思路
1. 做好背景调查，这种表型有无证据是其他基因(B)引起
2. 判断A与B是否有关系
3. 检测A与B是否存在调控关系，通常通过过表达、干扰实验、双荧光素酶或者互作检测实验等的方法；
4. 看看是否能够需要再找出中间联系的基因；
5. 最后，找一条通路进行研究。
