表达载体构建

本实验主要是为了实现对小鼠SP1的过表达载体构建，后期要对该基因在小鼠的细胞中进行定位研究。

2.2 载体选择

针对该实验目的，得出结论对载体有3点要求：

（1）由于要进行定位研究，下游实验建议进行稳定细胞株构建，故我们选择慢病毒载体，以便下游可以进行慢病毒包装和稳定表达细胞株构建；

（2）同时需要选择一个含有与目的基因可以融合表达荧光基团，便于定位研究；

（3）含有抗性筛选基因，方便下游稳定细胞株筛选可用药物进行抗药性筛选。

故我们选择了pLVX-mCherry-N1载体，载体图谱如下:

该载体是慢病毒表达载体，主要的骨架结构是CMV-MCS-mCherry-PGK-puro,即SP1基因与mCherry红色荧光融合表达，同时还含有PURO抗性筛选基因。

2.3 选择酶切位点和引物设计

为了将目的片段与载体连接，需要目的基因与载体带上相同的限制性内切酶位点，酶切位点的选择，主要有以下几点原则:

(1)       酶切位点需要存在于载体的MCS中,但同时不能存在于目的基因序列中；

(2)       两个酶切位点之间至少要有几个碱基间隔,不能紧邻或重叠；

(3)       最好选择成熟的内切酶；

(4)       双酶切后末端不会发生自连

根据以上几点原则，我们选择了XhoI和EcoRI限制性酶切位点。由于需要将SP1目的基因扩增出来，需要进行引物设计，设计的引物序列如下：

SP1-XhoI-F: gatctcgag gccacc atgagcgaccaagatcac   

SP1-EcoRI-R:gcagaattcgaaaccattgccactgatatt   

2.4       PCR扩增

以小鼠胚胎成纤维细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在目的基因两端分别引入XhoI和 EcoRI的酶切位点，PCR反应条件和程序如下：

反应程序条件：

PCR反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，DNA凝胶回收试剂盒胶回收目的基因DNA条带（2343bp）。

2.5 目的基因片段和载体双酶切

对SP1基因PCR产物和pLVX-mCherry-N1质粒载体进行XhoI和EcoRI双酶切，酶切反应在37℃水浴反应3h；

反应结束后，将产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳，按照DNA凝胶回收试剂盒胶回收目的基因DNA片段和目的载体片段。

2.6 目的基因与载体连接

质粒pLVX-mCherry-N1酶切回收片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应过夜。连接的反应体系如下：

2.7 转化

取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激60s，立即置冰上放置2min, 加入预热至室温的300ul LB培养基， 37℃恒温摇床培养1h。吸取菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

2.8 挑取菌落PCR验证和测序验证

挑取数个菌落，用记号笔做好标记，用枪头将菌液蘸取少量放置配置好的体系中，进行PCR验证，反应体系如下：

反应程序条件：

PCR反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，对照Marker大小，选取正确的菌落加入含3ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，300rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒小量提取试剂盒按照说明书提取质粒，再进行测序验证。

2.9 酶切鉴定分析

对构建成功的克隆进行酶切检测，根据酶切的片段大小是否符合预期大小，酶切反应体系是：

PCR反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，对照Marker大小，判断是否符合预期，以下是酶切的电泳结果图：

根据marker的大小，可知酶切出的条带符合预期大小，条带的大小分别为8787（载体大小）和2355（SP1含酶切位点大小）

2.10 测序分析

对测序结果进行拼接，得到以下序列，序列经过软件与SP1目的基因序列进行比对，可以100%比对上。测序得到的序列如下：

CGCAAATGGGAGCATATAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGGCCACCATGAGCGACCAAGATCACTCCATGGATGAAGTGACAGCTGTGGTGAAGATTGAAAAAGATGTTGGTGGCAATAATGGGGGTAGCGGCAATGGTGGCGGTGCCGCCTTTTCTCAGACTCGAAGCAGCAGCACAGGCAGTAGCAGCAGCAGTGGTGGCGGAGGAGGGCAGGAATCCCAGCCATCTCCTTTGGCTCTGCTGGCAGCAACCTGCAGCAGAATTGAGTCACCCAATGAGAACAGCAACAACTCCCAGGGTCCGAGTCAGTCAGGGGGCACAGGTGAACTTGACCTCACAGCCGCACAACTTTCACAGGGTGCCAATGGCTGGCAGATCATCTCTTCCTCCTCTGGGGCTACCCCTACCTCAAAGGAACAGAGTGGCAACAGTACCAATGGCAGCGAGTCTTCCAAGAACCGCACAGTCTCTGGTGGGCAGTATGTTGTGGCTGCTACCCCCAACTTACAGAACCAGCAAGTTCTGACAGGTCTCCCTGGAGTAATGCCTAATATTCAGTATCAAGTAATCCCACAGTTCCAGACTGTTGATGGGCAGCAGCTGCAGTTTGCTGCCACTGGGGCCCAAGTGCAGCAGGATGGTTCTGGTCAAATACAGATCATACCAGGTGCAAACCAACAGATCATCCCAAATAGAGGAAGTGGGGGCAACATTATTGCTGCTATGCCAAATCTACTCCAGCAGGCTGTCCCCCTTCAAGGCCTTGCTAATAATGTGCTCTCAGGACAGACTCAGTATGTGACCAATGTACCAGTGGCCCTGAATGGGAACATCACCTTGCTACCTGTCAACAGCGTTTCTGCAGCTACCCTGACTCCCAGCTCTCAGGCAGGCACTATCAGCAGCTCTGGATCCCAGGAGAGCAGCTCACAGCCTGTCACCTCAGGGACTGCCATCAGTTCTGCCAGCTTGGTGTCATCACAAGCTAGTTCCAGCTCCTTTTTTACCAATGCCAATAGTTATTCAACAACTACTACCACCAGCAACATGGGAATTATGAACTTTACCAGCAGTGGCTCATCAGGGACTAGTTCTCAAGGCCAGACGCCCCAGAGGGTTGGTGGGCTACAAGGGTCTGATTCTCTGAACATCCAGCAGAACCAGACATCAGGAGGCTCGCTGCAAGGAAGTCAGCAGAAAGAGGGAGAGCAAAGTCAGCAGACACAGCAACAACAAATTCTTATTCAGCCTCAGCTAGTTCAAGGAGGACAAGCTCTTCAGGCCCTTCAAGCAGCACCATTGTCCGGACAGACCTTCACAACTCAAGCTATTTCCCAGGAAACCCTTCAGAACCTCCAGCTTCAGGCTGTTCAAAACTCTGGTCCCATCATCATTCGGACACCAACCGTGGGGCCCAATGGACAGGTCAGTTGGCAGACCCTTCAGCTGCAGAATCTTCAAGTTCAGAACCCACAAGCCCAGACAATCACCTTGGCCCCTATGCAGGGTGTTTCCTTGGGGCAGACTAGCAGCAGTAATACCACCCTAACACCCATTGCCTCAGCTGCCTCCATTCCTGCTGGCACAGTCACTGTGAATGCTGCTCAACTCTCCTCCATGCCAGGCCTCCAGACCATTAACCTCAGTGCATTGGGTACTTCAGGGATCCAGGTGCACCAGCTTCCAGGCCTGCCTTTGGCTATAGCAAACACCCCAGGTGATCATGGAACTCAACTTGGTCTTCATGGATCTGGTGGTGATGGGATACATGATGAGACAGCAGGTGGAGAAGGAGAGAATAGCTCTGATCTCCAACCCCAAGCTGGACGCAGGACTCGTCGGGAAGCATGTACATGCCCCTATTGCAAAGACAGTGAGGGAAGAGCCTCAGGAGATCCTGGCAAAAAGAAACAGCACATTTGTCACATCCAAGGATGCGGCAAAGTATATGGCAAGACCTCACATCTCCGAGCACACTTGCGCTGGCATACAGGGGAGAGGCCATTCATGTGTAATTGGTCATATTGTGGGAAGCGCTTTACACGTTCGGACGAGCTTCAGAGACATAAACGTACACATACAGGAGAGAAGAAATTTGCCTGCCCTGAGTGCCCTAAGCGTTTCATGAGGAGTGATCACCTGTCAAAGCATATCAAGACTCACCAGAACAAGAAGGGAGGCCCAGGTGTAGCCCTGAGTGTGGGCACATTGCCCCTGGACAGTGGGGCAGGTTCAGAAGGCACTGCCACTCCTTCAGCCCTTATTACCACCAATATGGTAGCCATGGAGGCCATCTGTCCAGAGGGTATTGCCCGTCTTGCCAACAGTGGCATCAACGTCATGCAGGTGACAGAGCTGCAGTCCATTAATATCAGTGGCAATGGTTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGCCCGGGATGTAGCAGCATTTTCCCCCC

结论： SP1构建于pLVX-mCherry-N1载体的实验完成。

3       结果提交

对于构建完成的载体，我们会提供以下材料和资料：

（1）构建好的载体质粒2ug和甘油菌1ml；

（2）原始测序结果；

（3）酶切电泳图；

（4）实验报告（包含实验材料和试剂，方法及结果分析）。