稳定细胞株构建

1. 技术简介

我们采用基于慢病毒介导的方式将外源片段稳定整合入宿主细胞的基因组中，该方法特别适合于构建基因表达或干扰的稳转细胞株。慢病毒感染法比质粒转染更容易操作，并且对各类细胞的转导效率都很高。建立稳转细胞系，可以降低频繁转染或者病毒包装的成本，方便在目的细胞中研究基因功能实验研究。

2．基因整合细胞的过程

侵染细胞（与膜受体结合）

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病毒RNA逆转录（病毒自带逆转录系统）

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双链DNA整合（病毒自带整合酶系统）

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基因转录、表达（宿主系统发挥作用）

3. 稳定细胞株构建流程简介

（1）确定目的细胞系是否可以被慢病毒感染，在正式筛选细胞之前，先用对照慢病毒感染目的细胞系，以确定该细胞是否具有慢病毒亲嗜性；

（2）预实验确定MOI值，可通过查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI值也可参考查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适MOI；

（3）预实验确定筛选药物用量，常用的药物筛选有：puro、G418、潮霉素等；

（4）将目的细胞铺板与24孔板中；

（5）按照预实验确定的MOI值，加入适量的慢病毒感染细胞；

 （6）感染4-6h后，给细胞换液，洗掉未感染上的慢病毒；

 （7）感染48h后加入相应的抗性药物对细胞进行筛选；

（8）筛选后的细胞为混合克隆细胞，如果只需要得到混合克隆，则可以对细胞进行扩大培养；如果需要得到单克隆细胞，则需要在筛选结束后再对细胞进行单克隆培养，扩大培养后获取得到单克隆稳定细胞株。

4. 客户提供

（1）待测的目的基因信息（物种、Genebank登录号或基因序列）；

（2）细胞样本及其培养信息；

（3）构建要求，如荧光、抗性要求等

5. 结果交付

（1）过表达稳定细胞株及其对照细胞株；

（2）构建好的载体；

（3）测序数据；

（4）稳定细胞株表达检测数据，如Western blot检测数据、实时荧光定量PCR检测数据等；

（5）详细的实验报告（包含实验仪器、耗材和试剂、实验方法、结果分析）

6. 结果案例

经过筛选后的稳定细胞株通常可以稳定传代，以上是经过10次传代后拍摄的荧光细胞图。