荧光定量PCR
1. 技术简介
实时荧光定量PCR(real-time quantitativePCR),是指在PCR反应体系中加入荧光染料SYBR或荧光标记的特异性探针，利用荧光信号的积累实时在线监控PCR反应过程，由于在PCR扩增基因的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据，可以实现对目的基因在样本中的相对定量或绝对定量。
荧光定量PCR不仅实现真正实现了绝对定量，而且具有灵敏度和特异性、高能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，实时荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景十分广阔。
2. 方法介绍
根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质有荧光染料和荧光探针两类，根据使用荧光物质不同，该技术常用的方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。
2.1 SYBR Green染料法
目前主要使用的荧光染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I是一种能与DNA双链小沟的特异性结合染料。游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，而结合双链DNA后，则会发射荧光信号。在荧光定量PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产 物不断积累，荧光信号也会相应的增加，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。
荧光染料的优点：使用简便；可以与任何PCR产物结合；价格便宜
2.2 TaqMan探针法
Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，根据目的基因设计合成特异性的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。
TaqMan探针技术的优点：
荧光背景低；
敏感性高；
稳定性高；
特异性高。
3. 实验方法
（1）根据目的基因序列分别设计特异性的引物或者荧光探针；
（2）提取各样本DNA/RNA、RNA反转录、跑电泳、测浓度；
（3）去基因组DNA，RNA反转录；
（4）配置PCR反应体系，加入模板、引物、染料和dNTP等体系所需的溶液；
（5） RealTime PCR(荧光定量PCR)扩增，
（6）拿到下机数据，进行扩增曲线、溶解曲线、表达量差异等分析。
4. 案例分析
4.1 RNA提取
华丘生物根据客户的样本类型采用对应的提取试剂盒提取.RNA的质量在定量中非常作用，除了在RNA抽提过程中需要严格按照要求操作外，我们希望客户提供新鲜的材料，在严谨的RNA抽提操作中获得更高品质的RNA。
| Sample ID | Sample Type | OD260/280 | Conc. (ng/ul) |
|
control |
RNA |
1.947 |
296.88 |
|
Sample1 |
RNA |
1.866 |
207.48 |
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Sample2 |
RNA |
1.898 |
217.08 |
图1 RNA凝胶电泳图
4.2 荧光定量PCR反应
反应过程中，通过扩增曲线图形即可初步判断扩增效率，通过溶解曲线可评估扩增产物的特异性。下图为使用仪器自带软件导出的扩增曲线和溶解曲线图，我们会对每一个样品进行3复孔平行扩增，并拟合扩增曲线及溶解曲线。
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目的基因扩增曲线 |
内参基因扩增曲线 |
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目的基因溶解曲线 |
内参基因溶解曲线 |
4.3 荧光定量PCR实验数据分析
每样品分三复孔平行检测，根据PCR扩增的CT值，计算样本中目的基因的相对/绝对表达量。
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Sample ID |
control |
Sample1 |
Sample2 |
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Target geneCт |
19.67 |
19.56 |
19.56 |
21.02 |
21.01 |
21.00 |
21.93 |
21.93 |
21.97 |
|
GAPDH Ct |
15.88 |
15.89 |
15.89 |
16.34 |
16.32 |
16.45 |
16.34 |
16.32 |
16.33 |
图2 基因相对表达量柱状图
